Цитаты из книг автора «Александр Панчин»

Чем отличается метод дробления ДНК от тех методов, которые использовал международный консорциум по чтению генома человека? Обычные методы подразумевают последовательный анализ генома: мы шагаем по хромосомам, читая фрагмент за фрагментом. Концы предыдущих прочитанных фрагментов выступают затравками для чтения новых и так далее. Этот подход надежен и неизбежно приводит к нужному результату, не требует каких-то сложных алгоритмов для анализа данных, но очень медлителен и требует серьезных усилий со стороны ученых-экспериментаторов, которым приходится ставить эксперимент за экспериментом, реакцию за реакцией. Метод раздробления генома начал применяться для чтения коротких фрагментов ДНК еще в 1979 году271, но мало кто верил, что с его помощью можно будет прочитать большой геном. Мы взяли ДНК, раздробили, прочитали разрозненный набор фрагментов, которые называются чтениями. И что дальше? Как мы все это соберем? И можно ли вообще собрать такой “пазл”? Задача по “сборке” генома из чтений легла на специалистов в области вычислительной биологии – биоинформатики, еще одного бурно развивающегося направления современной науки. Возьмем множество прочитанных фрагментов ДНК. Найдем такую пару последовательностей, которые имеют хорошее перекрытие, объединим их и получим более длинный фрагмент. Последовательно сшивая перекрывающиеся фрагменты, мы будем получать все более длинные последовательности, пока в идеале не получим целые хромосомы. Иллюстрация такого объединения фрагментов приведена ниже.

Идея прочитать геном человека родилась еще в 1986 году по инициативе Министерства энергетики США – впоследствии оно же финансировало проект вместе с Национальными институтами здравоохранения США. При стоимости в 3 миллиарда долларов проект, в котором участвовали Китай, Германия, Франция, Великобритания и Япония, был рассчитан на 15 лет. Директором проекта по чтению генома человека был Джеймс Уотсон, один из первооткрывателей структуры молекулы ДНК, пока его не сменил Фрэнсис Коллинз. Позволю себе предположить, что международный проект по чтению генома человека затянулся бы не на тринадцать, а на все двадцать лет, если бы не старания весьма амбициозного ученого – Крейга Вентера. Крейг Вентер и его компания Celera Genomics, основанная в 1998 году, сыграли примерно такую же роль в истории геномики, как Советский Союз в истории полета американцев на Луну. Вентер заявил, что его компания закончит расшифровку генома человека раньше, чем завершится международный проект, а именно к 2001 году. Международный проект задерживался и, по новым оценкам, должен был завершиться в 2005-м. Причем сделать геном человека Вентер собирался не за миллиарды долларов, а всего за 300 миллионов благодаря новому подходу к чтению ДНК, названному whole genome shotgun (раздробление генома, или “метод дробовика”) и основанному на фрагментации ДНК и чтении случайных коротких участков генома в произвольном порядке.

В 1985 году метод Сенгера был доработан в лаборатории Лероя Худа. Там придумали, как заменить радиоактивную метку на четыре типа флуоресцентных меток: были получены терминирующие нуклеотиды, каждый из которых имел свой цвет267. Теперь все реакции можно было проводить в одной пробирке. Поскольку окрашены только терминирующие нуклеотиды, а при их присоединении синтез ДНК останавливается, каждая молекула ДНК будет окрашена в тот цвет, в который был окрашен последний присоединенный к ней (терминирующий) нуклеотид. Как и раньше, терминирующих нуклеотидов добавлялось совсем немного, чтобы получались последовательности всех возможных длин. Эти последовательности разделялись по длине на геле, но дальнейший анализ делала машина, которая самостоятельно считывала цвет каждой полоски на геле и определяла по цвету, какая там буква. Так был создан прибор для автоматизированного чтения ДНК.

Для анализа ДНК по методу Сенгера, как и в случае с методом Гилберта и Максама, нужно было использовать четыре пробирки. Во все пробирки добавлялись анализируемый образец ДНК, ДНК-полимераза и обычные нуклеотиды. Кроме того, в каждую из пробирок добавлялось небольшое количество терминирующих нуклеотидов одного из четырех типов, помеченных радиоактивной меткой. Наконец, в каждую пробирку добавлялись праймеры. Обычно праймеры синтезируются путем последовательного химического соединения нуклеотидов. Они подбираются комплементарными некоторому уже известному участку анализируемой молекулы ДНК, продолжение которой мы хотим прочитать. Без праймеров ДНК-полимераза не может начать синтез. В каждой из четырех пробирок происходит синтез ДНК, праймеры начинают достраиваться до полноразмерных цепочек, последовательности растут, но как только присоединяется терминирующий нуклеотид, синтез останавливается, и чем раньше это произойдет, тем короче получится фрагмент ДНК. Поскольку терминирующие нуклеотиды представляют небольшую долю от общего числа нуклеотидов в смеси, получаются как короткие, так и длинные фрагменты ДНК. Дальше продукты реакций из четырех пробирок наносятся на гель (каждый в свою лунку), через который пускается ток. Фрагменты выстраиваются по длине, делается снимок радиоактивности, по которому восстанавливается последовательность ДНК.

Самый короткий фрагмент заканчивается нуклеотидом G. Он “убежит” вперед и со временем окажется ближе всех к положительному полюсу. После нуклеотида G разрезание происходило только в первой пробирке, поэтому мы видим одну полосу в крайнем левом ряду. Второй по длине фрагмент заканчивается на нуклеотид А. После этого нуклеотида разрезы происходили в первой и второй пробирках, поэтому мы видим полосы в двух левых рядах. Чтение ДНК по таким снимкам напоминало чтение музыкальных нот с листа, только в этом процессе, как правило, участвовало двое ученых: один, глядя на снимок, называл нуклеотиды, а другой записывал букву за буквой.

В 1977 году Уолтер Гилберт и Аллан Максам предложили первый метод чтения ДНК265. Образец ДНК, содержащий анализируемую последовательность, помещали в четыре пробирки. В каждой из пробирок проводились химические реакции, в ходе которых нуклеотидные последовательности разрезались после разных букв. В первой пробирке молекула ДНК разрезалась после нуклеотидов А или G, во второй – после нуклеотида A, в третьей – после C, а в четвертой – после С или T. В итоге получались фрагменты всевозможной длины. Продукты реакций помещали в четыре параллельные лунки, проделанные внутри специального геля, через который пускали ток.

Генная инженерия отличается от селекции только тем, что это более точный и быстрый процесс с меньшим количеством нежелательных побочных эффектов.

Если лимфоцит столкнулся с антигеном, например с молекулой на поверхности бактерии, и распознал его, он начинает активно делиться. Одновременно запускаются клеточные процессы, приводящие к появлению новых мутаций в генах иммуноглобулинов116. Это способствует эволюции лимфоцитов: если мутации приводят к более прочной связи с антигеном, лимфоциты делятся активнее и их становится больше, если мутация приводит к тому, что антиген связывается хуже, – темпы деления замедляются. Размножаются самые удачливые, и в итоге иммунная система обогащается лимфоцитами, хорошо связывающими антиген.

Ребенок не только получает некую уникальную комбинацию генетических вариантов от родителей, но еще около пятидесяти совершенно новых генетических вариантов, которых ни у кого из родителей не было.

селекции или естественного отбора безопаснее продуктов генной инженерии?